Полуавтоматический метод аннотирования фазово-контрастных изображений живых культур клеток для сегментации ядер на основе машинного обучения

В текущей работе разработан комплексный подход для определения ядер живых клеток на изображениях без флуоресцентных меток. Поскольку в клеточной биологии актуальными являются подсчет клеток, оценка динамики роста клеток и конфлюентности, то существует целесообразность в автоматизации получения этих данных. Для автоматизации применяют алгоритмы на основе машинного обучения, которые необходимо обучать на изображениях конкретных культур клеток. Обучение алгоритмов является трудоемким процессом и требует длительной ручной разметки. Также доступные методы анализа на основе машинного обучения обладают низкой точностью определения живых клеток без флуоресцентной окраски. Цель исследования: упростить создание набора данных аннотированных клеток с последующим обучением алгоритмов на изображениях живых культур клеток. Материалы и методы. Методика включала использование сверточных нейронных сетей на основе алгоритма для сегментации ядер клеток на флуоресцентных и гистологических изображениях StarDist. Для создания аннотированных фазово-контрастных изображений культуры клеток образцы окрашивали ядерным флуоресцентным красителем DAPI с последующей отбраковкой некачественных изображений при помощи классификации в программе Cellprofiler Analyst. Обучение модели на основе StarDist проводили на 1130 изображениях автоматически аннотированных ядер на фазово-контрастных изображениях культуры эпителиальных клеток респираторного тракта человека, полученных на объективе 10×, размером 1600×1200 пикселей и глубиной цвета 16 бит. Результаты исследования. Полученная модель показала хорошую точность (F₁ = 0,765) сегментации ядер на валидационном наборе данных. Модель применили для определения времени удвоения популяции культуры эпителиальных клеток. Заключение: разработанный подход позволил создать аннотации и обучить модель машинного обучения для получения данных без применения флуоресцентных меток «label-free» на живых культурах клеток.

1. Ayanzadeh A., Yağar H.O., Özuysal Ö.Y., Okvur D.P., Töreyin B.U., Ünay D., Önal S. Cell segmentation of 2D phase-contrast microscopy images with deep learning method // 2019 Medical Technologies Congress (TIPTEKNO). IEEE, 2019. P. 1–4.

2. Kirillov A., Mintun E., Ravi N., Mao H., Rolland C., Gustafson L., et al. Segment anything // Proceedings of the IEEE/CVF International Conference on Computer Vision. 2023. P. 4015–4026.

3. Kakumani A.K., Padma Sree L. A Deep Learning Approach for Segmenting Time-Lapse Phase Contrast Images of NIH 3T3 Fibroblast Cells // New Trends in Computational Vision and Bio-inspired Computing: Selected works presented at the ICCVBIC 2018, Coimbatore, India. Cham: Springer International Publishing, 2020. P. 855–862.

4. Shamshad F., Khan S., Zamir S.W., Khan M.H., Hayat M., Khan F.S., Fu H. Transformers in medical imaging: A survey // Medical Image Analysis. 2023. Vol. 88. P. 102802.

5. Greenwald N.F., Miller G., Moen E., Kong A., Kagel A., Dougherty T., et al. Whole-cell segmentation of tissue images with human-level performance using large-scale data annotation and deep learning // Nature Biotechnology. 2022. Vol. 40, № 4. P. 555–565.

6. Stringer C., Wang T., Michaelos M., Pachitariu M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation // Nature Methods. 2021. Vol. 18, № 1. P. 100–106.

7. Lee M.Y., Bedia J.S., Bhate S.S., Barlow G.L., Phillips D., Fantl W.J., et al. CellSeg: a robust, pre-trained nucleus segmentation and pixel quantification software for highly multiplexed fluorescence images // BMC Bioinformatics. 2022. Vol. 23, № 1. P. 46.

8. Holme B., Bjørnerud B., Pedersen N.M., de la Ballina L.R., Wesche J., Haugsten E.M. Automated tracking of cell migration in phase contrast images with CellTraxx // Scientific Reports. 2023. Vol. 13, № 1. P. 22982.

9. Hörst F., Rempe M., Heine L., Seibold C., Keyl J., Baldini G., et al. Cellvit: Vision transformers for precise cell segmentation and classification // Medical Image Analysis. 2024. Vol. 94. P. 103143.

10. Berg S., Kutra D., Kroeger T., Straehle C.N., Kausler B.X., Haubold C., et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio) image analysis // Nature Methods. 2019. Vol. 16, № 12. P. 1226–1232.

11. Ali R., Gooding M., Szilágyi T., Vojnovic B., Christlieb M., Brady M. Automatic segmentation of adherent biological cell boundaries and nuclei from brightfield microscopy images // Machine Vision and Applications. 2012. Vol. 23, № 4. P. 607–621.

12. Cross-Zamirski J.O., Mouchet E., Williams G., Schönlieb C.B., Turkki R., Wang Y. Label-free prediction of cell painting from brightfield images // Scientific Reports. 2022. Vol. 12, № 1. P. 10001.

13. Pachitariu M., Stringer C. Cellpose 2.0: how to train your own model // Nature Methods. 2022. Vol. 19, № 12. P. 1634–1641.

14. Demchenko A., Belova L., Balyasin M., Kochergin-Nikitsky K., Kondrateva E., Voronina E., et al. Airway basal cells from human-induced pluripotent stem cells: a new frontier in cystic fibrosis research // Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2024. Vol. 12. P. 1336392.

15. Stirling D.R., Swain-Bowden M.J., Lucas A.M., Carpenter A.E., Cimini B.A., Goodman A. Cell-Profiler 4: improvements in speed, utility and usability // BMC Bioinformatics. 2021. Vol. 22, № 1. P. 433.

16. Stirling D.R., Carpenter A.E., Cimini B.A. CellProfiler Analyst 3.0: accessible data exploration and machine learning for image analysis // Bioinformatics. 2021. Vol. 37, № 21. P. 3992–3994.

17. Schmidt U., Weigert M., Broaddus C., Myers G. Cell detection with star-convex polygons // International Conference on Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention. Cham: Springer International Publishing, 2018. P. 265–273.

18. Tsai H.F., Gajda J., Sloan T.F., Rares A., Shen A.Q. Usiigaci: Instance-aware cell tracking in stain-free phase contrast microscopy enabled by machine learning // SoftwareX. 2019. Vol. 9. P. 230–237.

19. Fazeli E., Roy N.H., Follain G., Laine R.F., von Chamier L., Hänninen P.E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate // F1000Research. 2020. Vol. 9. P. 1279.

20. Moen E., Borba E., Miller G., Schwartz M., Bannon D., Koe N., et al. Accurate cell tracking and lineage construction in live-cell imaging experiments with deep learning // bioRxiv. 2019. 803205.