Разработка репортерной клеточной линии для визуализации PI₃K-сигналинга в процессе адипогенной дифференцировки МСК

Цель: ряд гормонов и паракринных факторов: инсулин, адипонектин, лептин, инсулиноподобный фактор роста-1, -2 активируют сигнальный путь фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и оказывают значительное влияние на адипогенную дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК). Настоящая работа была направлена на создание инструмента на основе генетически кодируемого биосенсора PH-GFP для определения взаимосвязи между гормональной сигнализацией и долгосрочным клеточным ответом, таким как дифференцировка клеток. 

Методы. Клеточная линия МСК, иммортализованная теломеразой человека (hTERT), была трансдуцирована лентивирусным вектором, несущим генетическую последовательность на основе домена плекстриновой гомологии тирозинкиназы Брутона, соединенного с зеленым флуоресцентным белком (PH-GFP). Отбор трансдуцированных клеток проводили методом проточной цитометрии. Полученная линия МСК[GFP-PH] была охарактеризована по флуоресцентному ответу на PDGF и инсулин, дифференцировочному потенциалу с применением стандартных протоколов индукции дифференцировки, а также по скорости пролиферации с использованием нейронных сетей для подсчета клеток. 

Результаты. Было установлено, что клеточная линия hTERT МСК[GFP-PH] обладает неизмененным адипогенным и остеогенным потенциалом по сравнению с немодифицированной линией. hTERT МСК[GFP-PH] позволяет регистрировать сигналинг инсулина и других агонистов PI3K в живых клетках в режиме реального времени как в МСК, находящихся в недифференцированном состоянии, так и в МСК в процессе адипогенной дифференцировки. Для упрощения анализа сигнальных событий был применен вычислительный подход, обеспечивающий улучшенную визуализацию сигнала, а также введена специальная метрика для оценки активации PI3K сигнального пути. 

Заключение. Таким образом, МСК[GFP-PH] представляет собой перспективную клеточную линию для изучения PI3K-сигналинга в реальном времени в условиях длительных клеточных процессов, таких как адипогенная дифференцировка. Предложенный вычислительный подход может оказаться удобным решением для детекции сигнальных событий с помощью биосенсора PH-GFP на уровне единичных клеток.

1. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapypositionstatement.Cytotherapy.2006;8(4):315–317.DOI:10.1080/14653240600855905

2. Jimenez-Puerta GJ, Marchal JA, López-Ruiz E, Gálvez-Martín P. Role of Mesenchymal Stromal Cells as Therapeutic Agents: Potential Mechanisms of Action and Implications in Their Clinical Use. J Clin Med. 2020 Feb 6;9(2):445. DOI: 10.3390/jcm9020445

3. Chen Q, Shou P, Zheng C, Jiang M, Cao G, Yang Q, et al. Fate decision of mesenchymal stem cells: adipocytes or osteoblasts? Cell Death Differ. 2016 Jul;23(7):1128–1139. DOI: 10.1038/cdd.2015.168

4. Chen J, Crawford R, Chen C, Xiao Y. The key regulatory roles of the PI3K/Akt signaling pathway in the functionalities of mesenchymal stem cells and applications in tissue regeneration. Tissue Eng Part B Rev. 2013 Dec;19(6):516–528. DOI: 10.1089/ten.TEB.2012.0672

5. Riehle RD, Cornea S, Degterev A. Role of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate in cell signaling. Adv Exp Med Biol. 2013;991:105–139. DOI: 10.1007/978-94-007-6331-9_7

6. Armoni M, Kritz N, Harel C, Bar-Yoseph F, Chen H, Quon MJ, Karnieli E. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma represses GLUT4 promoter activity in primary adipocytes, and rosiglitazone alleviates this effect. J Biol Chem. 2003 Aug 15;278(33):30614–30623. DOI: 10.1074/jbc.M304654200

7. Tong Q, Dalgin G, Xu H, Ting CN, Leiden JM, Hotamisligil GS. Function of GATA transcription factors in preadipocyte-adipocyte transition. Science. 2000 Oct 6;290(5489):134–138. DOI: 10.1126/science.290.5489.134

8. Tong Q, Tsai J, Tan G, Dalgin G, Hotamisligil GS. Interaction between GATA and the C/EBP family of transcription factors is critical in GATA-mediated suppression of adipocyte differentiation. Mol Cell Biol. 2005 Jan;25(2):706–715. DOI: 10.1128/MCB.25.2.706-715.2005

9. Zhao X, Gan L, Pan H, Kan D, Majeski M, Adam SA, Unterman TG. Multiple elements regulate nuclear/cytoplasmic shuttling of FOXO1: characterization of phosphorylation- and 14-3-3-dependent and -independent mechanisms. Biochem J. 2004 Mar 15;378(Pt 3):839–849. DOI: 10.1042/BJ20031450

10. Matsuzaki H, Daitoku H, Hatta M, Tanaka K, Fukamizu A. Insulin-induced phosphorylation of FKHR (Foxo1) targets to proteasomal degradation. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Sep 30;100(20):11285–11290. DOI: 10.1073/pnas.1934283100

11. Menghini R, Marchetti V, Cardellini M, Hribal ML, Mauriello A, Lauro D, et al. Phosphorylation of GATA2 by Akt increases adipose tissue differentiation and reduces adipose tissue-related inflammation: a novel pathway linking obesity to atherosclerosis. Circulation. 2005 Apr 19;111(15):1946–1953. DOI: 10.1161/01.CIR.0000161814.02942.B2

12. Yeh WC, Bierer BE, McKnight SL. Rapamycin inhibits clonal expansion and adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Nov 21;92(24):11086–11090. DOI: 10.1073/pnas.92.24.11086

13. Martin SK, Fitter S, Dutta AK, Matthews MP, Walkley CR, Hall MN, et al. Brief report: the differential roles of mTORC1 and mTORC2 in mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 2015 Apr;33(4):1359–1365. DOI: 10.1002/stem.1931

14. Kim JE, Chen J. regulation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activity by mammalian target of rapamycin and amino acids in adipogenesis. Diabetes. 2004 Nov;53(11):2748–2756. DOI: 10.2337/diabetes.53.11.2748

15. Laplante M, Sabatini DM. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 2012 Apr 13;149(2):274–293. DOI: 10.1016/j.cell.2012.03.017

16. Filhoulaud G, Guilmeau S, Dentin R, Girard J, Postic C. Novel insights into ChREBP regulation and function. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 2013;24(5):257–268. DOI: 10.1016/j.tem.2013.01.003

17. Moreno-Navarrete JM, Botas P, Valdés S, Ortega FJ, Delgado E, Vázquez-Martín A, et al. Val1483Ile in FASN gene is linked to central obesity and insulin sensitivity in adult white men. Obesity (Silver Spring, Md.). 2009;17(9):1755–1761.

18. Foretz M, Guichard C, Ferré P, Foufelle F. Sterol regulatory element binding protein-1c is a major mediator of insulin action on the hepatic expression of glucokinase and lipogenesis-related genes. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Oct 26;96(22):12737–12742. DOI: 10.1073/pnas.96.22.12737

19. Zhou X, Mehta S, Zhang J. Genetically Encodable Fluorescent and Bioluminescent Biosensors Light Up Signaling Networks. Trends Biochem Sci. 2020 Oct;45(10):889–905. DOI: 10.1016/j.tibs.2020.06.001

20. Ni Q, Mehta S, Zhang J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. FEBS J. 2018 Jan;285(2):203–219. DOI: 10.1111/febs.14134

21. Greenwald EC, Mehta S, Zhang J. Genetically Encoded Fluorescent Biosensors Illuminate the Spatiotemporal Regulation of Signaling Networks. Chem Rev. 2018 Dec 26;118(24):11707–11794. DOI: 10.1021/acs.chemrev.8b00333

22. Várnai P, Rother KI, Balla T. Phosphatidylinositol 3-kinase-dependent membrane association of the Bruton’s tyrosine kinase pleckstrin homology domain visualized in single living cells. J Biol Chem. 1999 Apr 16;274(16):10983–10989. DOI: 10.1074/jbc.274.16.10983

23. Primak A, Kalinina N, Skryabina M, Usachev V, Chechekhin V, Vigovskiy M, et al. Novel Immortalized Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cell Line for Studying Hormonal Signaling. Int J Mol Sci. 2024 Feb 19;25(4):2421. DOI: 10.3390/ijms25042421

24. Tyurin-Kuzmin PA, Karagyaur MN, Kulebyakin KY, Dyikanov DT, Chechekhin VI, Ivanova AM, et al. Functional Heterogeneity of Protein Kinase A Activation in Multipotent Stromal Cells. Int J Mol Sci. 2020 Jun 22;21(12):4442. DOI: 10.3390/ijms21124442

25. Longo PA, Kavran JM, Kim MS, Leahy DJ. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enzymol. 2013;529:227–240. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5

26. Puhl AC, Milton FA, Cvoro A, Sieglaff DH, Campos JC, Bernardes A, et al. Mechanisms of peroxisome proliferator activated receptor γ regulation by non-steroidal anti-inflammatory drugs. Nucl Recept Signal. 2015 Oct 5;13:e004. DOI: 10.1621/nrs.13004

27. Várnai P, Balla T. Visualization of phosphoinositides that bind pleckstrin homology do-mains: calcium- and agonist-induced dynamic changes and relationship to myo-[3H.ino-sitol-labeled phosphoinositide pools. J Cell Biol. 1998 Oct 19;143(2):501–510. DOI: 10.1083/jcb.143.2.501

28. Fedorovsky, A.P., Karagyaur, M.N., Voloshin, N.S., et al. The Features of the Genetically-Encoded Biosensor to PIP3 Influence on Insulin Signaling in MSCs. Biochem. Moscow Suppl. Ser. B 2024;18 (Suppl 1);S91–S98. DOI: 10.1134/S1990750824601103

29. Chang J, Liu F, Lee M, Wu B, Ting K, Zara JN, et al. NF-κB inhibits osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells by promoting β-catenin degradation. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Jun 4;110(23):9469–9474. DOI: 10.1073/pnas.1300532110. Epub 2013 May 20. Erratum in: Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Aug 13;110(33):13690.

30. Recinella L, Orlando G, Ferrante C, Chiavaroli A, Brunetti L, Leone S. Adipokines: New Potential Therapeutic Target for Obesity and Metabolic, Rheumatic, and Cardiovascular Diseases. Front Physiol. 2020 Oct 30;11:578966. DOI: 10.3389/fphys.2020.578966

31. Gupta N, Renugopalakrishnan V, Liepmann D, Paulmurugan R, Malhotra BD. Cell-based biosensors: Recent trends, challenges and future perspectives. Biosens Bioelectron. 2019 Sep 15;141:111435. DOI: 10.1016/j.bios.2019.111435

32. Kulebyakin K, Tyurin-Kuzmin P, Efimenko A, Voloshin N, Kartoshkin A, Karagyaur M, et al. Decreased Insulin Sensitivity in Telomerase-Immortalized Mesenchymal Stem Cells Affects Efficacy and Outcome of Adipogenic Differentiation in vitro. Front Cell Dev Biol. 2021 Aug 4;9:662078. DOI: 10.3389/fcell.2021.662078

33. Rosen ED, MacDougald OA. Adipocyte differentiation from the inside out. Nat Rev Mol Cell Biol. 2006 Dec;7(12):885–896. DOI: 10.1038/nrm2066

34. Smith PJ, Wise LS, Berkowitz R, Wan C, Rubin CS. Insulin-like growth factor-I is an essential regulator of the differentiation of 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 1988 Jul 5;263(19):9402–9408.

35. Boone DN, Lee AV. Targeting the insulin-like growth factor receptor: developing biomarkers from gene expression profiling. Crit Rev Oncog. 2012;17(2):161–173. DOI: 10.1615/cri-trevoncog.v17.i2.30

36. Ball SG, Shuttleworth CA, Kielty CM. Platelet-derived growth factor receptor-α is a key determinant of smooth muscle α-actin filaments in bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Int J Biochem Cell Biol. 2007;39:379–391.