Изменение остеодифференцировочного потенциала культуры МСК-ЖТ при in vitro сокультивировании с гепарином

Цель данного исследования — изучение влияния гепарина в концентрации 1 МЕ/мл на изменение остеодифференцировочного потенциала культуры МСК жировой ткани человека в условиях сокультивирования in vitro.

Материалы и методы. Оценка фенотипического профиля культуры МСК жировой ткани человека при культивировании в присутствии/отсутствии гепарина проводилась с помощью метода проточной цитометрии с использованием соответствующих красителей согласно протоколу фирмы-производителя на проточном цитофлуориметре MACS Quant после 14-суточного культивирования. Для оценки миграционного и пролиферативного потенциала МСК в присутствии гепарина использовалась электродная система непрерывного наблюдения — xCELLigence® RTCA DP. После 14-суточного культивирования МСК с гепарином производилась оценка внутриклеточной экспрессии генов остеодифференцировки методом ПЦР в реальном времени; кроме того, производилась оценка дифференцировочного профиля МСК жировой ткани человека при сокультивировании с гепарином методом цитологического окрашивания ализариновым красным с целью обнаружения островков минерализации спустя 21 сутки культивирования. Также в супернатантах 14-дневных культур оценивалось количество ростовых факторов, хемокинов, молекул с про- и противовоспалительной активностью.

Результаты. Выявлено достоверное снижение (относительно контрольной группы исследования) количества клеток, несущих на клеточной поверхности маркеры МСК (CD73, CD90, CD105) культуры в модели МСК + гепарин; повышение пролиферативной и снижение миграционной активности МСК при сокультивировании с гепарином; повышение уровней относительной экспрессии мРНК генов остеодифференцировки (ALPL, RUNX2, BMP2, BMP6) и клеточной адгезии (CD49d); увеличение площади минерализации в модели исследования в присутствии гепарина после 21-суточного культивирования. Отмечена тенденция к увеличению секреции ростового фактора VEGF и провоспалительного фактора IL-6 в модели МСК + гепарин.

Заключение. Полученные результаты могут служить базисом для разработки новых терапевтических тактик ведения пациентов хирургического профиля при операциях остеосинтеза с высоким риском тромбообразования.

1. Labarrere C.A., Dabiri A.E., Kassab G.S. Thrombogenic and Inflammatory Reactions to Biomaterials in Medical Devices. Front. Bioeng. Biotechnol, 2020;8:123.

2. Han Q., Shea S.M., Arleo T., Qian J.Y., Ku D.N. Thrombogenicity of biomaterials depends on hemodynamic shear rate. Artifical organs. 2022;46(4):606–617.

3. Shah F.A., Thomsen P., Palmquist A. Osseointegration and current interpretations of the boneimplant interface. Acta Biomaterialia. 2019;84:1–15.

4. da Costa F.H.B., Lewis M.S., Truong A., Carson D.D., Farach-Carson M.C. SULF1 suppresses Wnt3A-driven growth of bone metastatic prostate cancer in perlecan-modified 3D cancerstroma- macrophage triculture models. Plos One. 2020;15(5):e0230354.

5. Brkljacic J., Pauk M., Erjavec I., Cipcic A., Grgurevic L., Zadro R., Inman G.J., Vukicevic S. Exogenous heparin binds and inhibits bone morphogenetic protein 6 biological activity. International Orthopaedics. 2013;37(3):529–541.

6. Moll G., Ankrum J.A., Olson S.D., Nolta J.A. Improved MSC Minimal Criteria to Maximize Patient Safety: A Call to Embrace Tissue Factor and Hemocompatibility Assessment of MSC Products. Stem Cells Translational Medicine. 2022;11(1):2–13.

7. Broeke J., Pérez J.M.M., Pascau J. Image Processing with Image J. 2nd Edition. UK: Packt Publishing (2015). 256 p.

8. Simann M., Schneider V., Le Blanc S., Dotterweich J., Zehe V., Krug M., Jakob F., Schilling T., Schütze N. Heparin affects human bone marrow stromal cell fate: Promoting osteogenic and reducing adipogenic differentiation and conversion. Bone. 2015;78:102–113.

9. Ling L., Camilleri E.T., Helledie T., Samsonraj R.M., Titmarsh D.M., Chua R.J., Dreesen O., Dombrowski C., Rider D.A., Galindo M., Lee I., Hong W., Hui J.H., Nurcombe V., van Wijnen A.J., Cool S.M. Effect of heparin on the biological properties and molecular signature of human mesenchymal stem cells. Gene. 2016;576(1):292–303.

10. Li Y., Fung J., Lin F. Local Inhibition of Complement Improves Mesenchymal Stem Cell Viability and Function After Administration. Molecular Therapy. 2016; 24(9):1665–1674.

11. Jain M., Minocha E., Tripathy N.K., Singh N., Chaturvedi C.P., Nityanand S. Comparison of the Cardiomyogenic Potency of Human Amniotic Fluid and Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Stem Cells. 2019;12:449–456.

12. Moraes D.A., Sibov T.T., Pavon L.F., Alvim P.Q., Bonadio R.S., Da Silva J.R., Pic-Taylor A., Toledo O.A., Marti L.C., Azevedo R.B., Oliveira D.M. A reduction in CD90 (THY-1) expression results in increased differentiation of mesenchymal stromal cell. Stem Cell Research & Therapy. 2016;7:97.

13. Qu C., Brohlin M., Kingham P.J., Kelk P. Evaluation of growth, stemness, and angiogenic properties of dental pulp stem cells cultured in cGMP xeno-/serum-free medium. Cell and Tissue Research. 2020;380:93–105.

14. Pham L.H., Vu N.B., Pham P.V. The subpopulation of CD105 negative mesenchymal stem cells show strong immunomodulation capacity compared to CD105 positive mesenchymal stem cells. Biomedical Research and Therapy. 2019;6(4):3131–3140.

15. Tan K., Zhu H., Zhang J., Ouyang W., Tang J., Zhang Y., Qiu L., Liu X., Ding Z., Deng X. CD73 Expression on Mesenchymal Stem Cells Dictates the Reparative Properties via Its Anti-Inflammatory Activity. Stem Cells International. 2019;2019:12.

16. Kimura K., Breitbach M., Schildberg F.A., Hesse M., Fleischmann B.K. Bone marrow CD73+ mesenchymal stem cells display increased stemness in vitro and promote fracture healing in vivo. Bone Reports. 2021;15:101–133.

17. Норкин И.К, Юрова К.А., Хазиахматова О.Г., Мелащенко Е.С., Малащенко В.В., Шунькин Е.О. и др. Стимулирующее влияние высоких доз гепарина на миграционную активность и сохранение стволовости МСК в присутствии остеозамещающих материалов. Медицинская иммунология. 2021;23(4):831–838. DOI: 10.15789/1563-0625-SEO228

18. Seeger F.H., Rasper T., Fischer A., Muhly-Reinholz M., Hergenreider E., Leistner D.M., Sommer K., Manavski Y., Henschler R., Chavakis E., Assmus B., Zeiher A.M., Dimmeler S. Heparin disrupts the CXCR4/SDF-1 axis and impairs the functional capacity of bone marrow-derived mononuclear cells used for cardiovascular repair. Circulation Research. 2012;111(7):854–862.

19. Laner-Plamberger S., Lener T., Schmid D., Streif D.A., Salzer T., Öller M., Hauser-Kronberger C., Fischer T., Jacobs V.R., Schallmoser K., Gimona M., Rohde E. Mechanical fibrinogen-depletion supports heparin-free mesenchymal stem cell propagation in human platelet lysate. Journal of Translational Medicine. 2015;13:354.

20. Fu X., Liu G., Halim A., Ju Y., Luo Q., Song G. Mesenchymal Stem Cell Migration and Tissue Repair. Cells. 2019;8(8):784.

21. Kim J., Yang Y., Park K.H., Ge X., Xu R., Li N., et al. A RUNX2 stabilization pathway mediates physiologic and pathologic bone formation. Nature Communications. 2020;11:2289.

22. Iyyanara P.P.R., Thangaraja M.P., Eames B.F., Nazarali A.J. Htra1 is a Novel Transcriptional Target of RUNX2 That Promotes Osteogenic Differentiation. Cell Physiol Biochem. 2019.53(5):832–850.

23. Yu S., Guo J., Sun Z., Lin C., Tao H., Zhang Q., et al. BMP2-dependent gene regulatory network analysis reveals Klf4 as a novel transcription factor of osteoblast differentiation. Cell Death & Disease. 2021;12:197.

24. Vimalraj S. Alkaline phosphatase: Structure, expression and its function in bone mineralization. Gene. 2020;754:144855.

25. Zheng J., Zhao F., Zhang W., Mo Y., Zeng L., Li X., Chen X. Sequentially-crosslinked biomimetic bioactive glass/gelatin methacryloyl composites hydrogels for bone regeneration. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 2018; 89:119–127.

26. Liu W., Zhang L., Xuan K., Hu C., Li L., Zhang Y., Jin F., Jin Y. Alkaline Phosphatase Controls Lineage Switching of Mesenchymal Stem Cells by Regulating the LRP6/GSK3β Complex in Hypophosphatasia. Theranostics. 2018;8(20):5575–5592.

27. Smith R.A.A., Murali S., Rai B., Lu X., Lim Z.X.H., Lee J.J.L., et al. Minimum structural requirements for BMP-2-binding of heparin oligosaccharides. Biomaterials. 2018;184:41–55.

28. Perry M.J., McDougall K.E., Hou S., Tobias J.H. Impaired growth plate function in bmp-6 null mice. Bone. 2008;42(1):216–225.

29. Jeon H., Yoon K., An E.S., Kang T.-W., Sim Y.-B., Ahn J., et al. Therapeutic Effects of Human Umbilical Cord Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells Combined with Cartilage Acellular Matrix Mediated Via Bone Morphogenic Protein 6 in a Rabbit Model of Articular Cruciate Ligament Transection. Stem Cell Reviews and Reports. 2020;16:596–611.

30. Wang X., Ye K., Li Z., Yan C., Ding J. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 2013;9(4):280– 286.

31. Vasilevich A.S., Vermeulen S., Kamphuis M., Roumans N., Eroumé S., Hebels D.G.A.J., et al. On the correlation between material-induced cell shape and phenotypical response of human mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 2020;10:18988.

32. Zhang L., Wang Z., Das J., Labib M., Ahmed S., Sargent E.H., Kelley S.O. Potential-Responsive Surfaces for Manipulation of Cell Adhesion, Release, and Differentiation. Angewandte Chemie International Edition. 2019;58(41):14519–14523.

33. Le Saux G., Wu M.C., Toledo E., Chen Y.-Q., Fan Y.-J., Kuo J.-C., Schvartzman M. Cell–Cell AdhesionDriven Contact Guidance and Its Effect on Human Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 2020;12(20):22399–22409.

34. Chigaev A., Smagley Y., Sklar L.A. Carbon monoxide down-regulates α4β1 integrin-specific ligand binding and cell adhesion: a possible mechanism for cell mobilization. BMC Immunology. 2014;15:52.

35. Pinto-Mariz F., Carvalho L.R, Araujo A.P.D.Q.C., Mello W.D., Ribeiro M.G., Cunha M.D.C.S.A., et al. CD49d is a disease progression biomarker and a potential target for immunotherapy in Duchenne muscular dystrophy. Skeletal Muscle. 2015;5:45.

36. Gockel L.M., Heyes M., Li H., Nahain A.A., Gorzelanny C., Schlesinger M., et al. Inhibition of Tumor–Host Cell Interactions Using Synthetic Heparin Mimetics. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2021;13(6):7080–7093.

37. Le Gall J., Dehainault C., Benoist C., Matet A., Lumbroso-Le Rouic L., et al. Highly Sensitive Detection Method of Retinoblastoma Genetic Predisposition and Biomarkers. The Journal of molecular diagnostics: JMD. 2021;23(12):1714–1721.

38. Chiodelli P., Bugatti A., Urbinati C., Rusnati M. Heparin/Heparan Sulfate Proteoglycans Glycomic Interactome in Angiogenesis: Biological Implications and Therapeutical Use. Molecules. 2015;20(4):6342–6388.

39. Abbadi A., Loftis J., Wang A., Yu M., Wang Y., Shakya S., et al. Heparin inhibits proinflammatory and promotes anti-inflammatory macrophage polarization under hyperglycemic stress. Journal of biological chemistry. 2020;295(15):4849–4857.

40. Dregalla R.C., Herrera J.A., Koldewyn L.S., Donner E.J. The Choice of Anticoagulant Influences the Characteristics of Bone Marrow Aspirate Concentrate and Mesenchymal Stem Cell Bioactivity In Vitro. Stem Cells International. 2022;2022:1–12.

41. Ge Q., Zhang H., Hou J., Wan L., Cheng W., Wang X., et al. VEGF secreted by mesenchymal stem cells mediates the differentiation of endothelial progenitor cells into endothelial cells via paracrine mechanisms. Molecular Medicine Reports. 2018;17(1):1667–1675.

42. Berendsen A.D., Olsen B.R. How vascular endothelial growth factor-A (VEGF) regulates differentiation of mesenchymal stem cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 2014;62(2):103–108.

43. Hu K., Olsen B.R. The roles of vascular endothelial growth factor in bone repair and regeneration. Bone. 2016;91:30–38.

44. Witt R., Weigand A., Boos A.M., Cai A., Dippold D., Boccaccini A.R., et al. Mesenchymal stem cells and myoblast differentiation under HGF and IGF-1 stimulation for 3D skeletal muscle tissue engineering. BMC Cell Biology. 2017;18:15.

45. Frisch R.N., Curtis K.M., Aenlle K.K., Howard G.A.. Hepatocyte Growth Factor and Alternative Splice Variants — Expression, Regulation and Implications in Osteogenesis and Bone Health and Repair. Expert opinion on therapeutic targets. 2016;20(9):1087–1098.