В современной биомедицине все острее ощущается недостаток данных о судьбах индивидуальных клеток в ходе онтогенеза сложного организма от зиготы до формирования зрелых тканей, что особенно актуально для таких сложноорганизованных органов, как сердце, головной и спинной мозг и др. Детализованное понимание этих процессов позволит разработать новые подходы к тканевой и клеточной инженерии и откроет возможности к коррекции не излечимых ранее заболеваний, включая нейродегенеративные, когнитивные и психические нарушения. Одним из наиболее информативных инструментов для установления клеточной генеалогии являются технологии генетического баркодирования, обзору которых и посвящено данное исследование. В обзоре литературы мы постарались проследить эволюцию технологий генетического баркодирования от ранних флуоресцентных систем (Brainbow, Confetti) до современных ДНК-баркодирующих платформ на основе программируемых нуклеаз Cas9 и Cas12a (GESTALT, MEMOIR, CARLIN, DuTracer и других). Мы рассмотрели и сравнили основные их свойства, возможности и ограничения, а также перспективы их применения в биологии развития и регенеративной биомедицине. Дальнейшее развитие технологий генетического баркодирования открывает новые возможности для создания информативных моделей заболеваний, валидации фармакологических мишеней и разработки клеточных продуктов для регенеративной медицины. Мы предполагаем, что данный обзор может быть интересен широкому кругу специалистов: разработчикам клеточных и генетических технологий, исследователям в области регенеративной биомедицины и биологии развития, специалистам по омиксным технологиям и исследователям в области возраст-ассоциированных, нейродегенеративных и онкогематологических заболеваний, поскольку охватывает различные аспекты ключевой технологии построения клеточной генеалогии для решения фундаментальных и прикладных задач широкого спектра биологических и медицинских наук.

В статье рассмотрен риск-ориентированный подход к формированию стратегии контроля качества биологических лекарственных препаратов с акцентом на роль стратегии аналитического контроля как ключевого элемента интегрированной системы обеспечения качества. Биологические лекарственные препараты обладают сложной структурой и функциональной гетерогенностью. Их качественные характеристики напрямую зависят от свойств исходных материалов и строгого соблюдения параметров производственного процесса. При этом современные методы анализа не всегда позволяют полностью оценить все аспекты качества таких молекул. Указанные особенности делают невозможным проведение исчерпывающего контроля только на финальном этапе. В связи с этим к аналитическому анализу биологических лекарственных препаратов применяется дифференцированный подход. Глубина и методы контроля в данном случае определяются индивидуально, исходя из степени потенциального риска для здоровья пациента. Методологической основой предложенной модели является концепция «качество, заложенное при разработке», в рамках которой стратегия контроля качества выстраивается на основе последовательной логической цепочки от назначения лекарственного препарата и клинического контекста его применения к целевому профилю качества продукта, выделению критических параметров качества и формированию требований к аналитическим методам и строгости их применения. Показано, что критические параметры качества должны определяться исходя из потенциального влияния их изменений на безопасность и эффективность лекарственного препарата, а не из доступности или удобства аналитических методик, и классифицироваться по характеру влияния на клинический профиль. Стратегия аналитического контроля рассматривается как заранее спроектированный совокупный набор аналитических и процедурных контролей, направленных на управление рисками за счет снижения вероятности аналитических ошибок и повышения способности выявлять клинически и технологически значимые изменения параметров продукта. В статье проанализированы принципы пригодности аналитических методов для конкретного назначения, роль целевого аналитического профиля и механизмы дифференциации строгости аналитического контроля в зависимости от уровня риска и стадии жизненного цикла лекарственного препарата.

Показано, что стратегия аналитического контроля носит динамический характер и закономерно эволюционирует по мере накопления знаний о продукте и производственном процессе: от расширенных исследовательских задач на ранних стадиях разработки к регламентированным режимам выпуска серий и исследований стабильности на стадии коммерческого производства. Предложенный подход формирует методологическую основу для проектирования, обоснования и управляемого пересмотра аналитического контроля биологических лекарственных препаратов на протяжении всего их жизненного цикла.

Краткий обзорно-лекционный материал посвящен одному из ключевых направлений регенеративной медицины тканевой инженерии с использованием стволовых и мультипотентных клеток. Среди рассматриваемых технологий: классическая тканевая инженерия с использованием скаффолдов, сфероидные подходы, клеточные пласты. В статье рассматриваются и освещены базовые принципы тканевой инженерии (триада компонентов, основные технологии) и ограничения, связанные с использованием данной группы подходов в клинической практике.

Цель: ряд гормонов и паракринных факторов: инсулин, адипонектин, лептин, инсулиноподобный фактор роста-1, -2 активируют сигнальный путь фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и оказывают значительное влияние на адипогенную дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК). Настоящая работа была направлена на создание инструмента на основе генетически кодируемого биосенсора PH-GFP для определения взаимосвязи между гормональной сигнализацией и долгосрочным клеточным ответом, таким как дифференцировка клеток. 

Методы. Клеточная линия МСК, иммортализованная теломеразой человека (hTERT), была трансдуцирована лентивирусным вектором, несущим генетическую последовательность на основе домена плекстриновой гомологии тирозинкиназы Брутона, соединенного с зеленым флуоресцентным белком (PH-GFP). Отбор трансдуцированных клеток проводили методом проточной цитометрии. Полученная линия МСК[GFP-PH] была охарактеризована по флуоресцентному ответу на PDGF и инсулин, дифференцировочному потенциалу с применением стандартных протоколов индукции дифференцировки, а также по скорости пролиферации с использованием нейронных сетей для подсчета клеток. 

Результаты. Было установлено, что клеточная линия hTERT МСК[GFP-PH] обладает неизмененным адипогенным и остеогенным потенциалом по сравнению с немодифицированной линией. hTERT МСК[GFP-PH] позволяет регистрировать сигналинг инсулина и других агонистов PI3K в живых клетках в режиме реального времени как в МСК, находящихся в недифференцированном состоянии, так и в МСК в процессе адипогенной дифференцировки. Для упрощения анализа сигнальных событий был применен вычислительный подход, обеспечивающий улучшенную визуализацию сигнала, а также введена специальная метрика для оценки активации PI3K сигнального пути. 

Заключение. Таким образом, МСК[GFP-PH] представляет собой перспективную клеточную линию для изучения PI3K-сигналинга в реальном времени в условиях длительных клеточных процессов, таких как адипогенная дифференцировка. Предложенный вычислительный подход может оказаться удобным решением для детекции сигнальных событий с помощью биосенсора PH-GFP на уровне единичных клеток.

Персистирующее низкоинтенсивное системное воспаление важное звено патогенеза возраст-ассоциированных заболеваний и, в частности, хронической сердечной недостаточности (ХСН). В целом ряде исследований показано повышение биомаркеров воспаления у пациентов, страдающих ХСН. Одним из механизмов поддержания хронического воспаления является накопление сенесцентных клеток, секретирующих комплекс биологически активных факторов, описываемых как секреторный фенотип, ассоциированный со старением (senescence-associated secretory phenotype, SASP). Перспективным подходом к лечению ХСН может стать применение сенолитической терапии, которая позволяет селективно элиминировать сенесцентные клетки и снизить уровень вызванного ими воспаления. Препарат с сенолитическим действием дигидрокверцетин продемонстрировал свои эффекты в экспериментальных исследованиях, его безопасность показана в клинических исследованиях по другим показаниям. Эти данные позволили выбрать его для решения задачи, поставленной в настоящей работе: оценить влияние терапии дигидрокверцетином на биомаркеры накопления сенесцентных клеток и клиническое состояние пациентов с ХСН старшей возрастной группы.

Цель. Оценить влияние разных доз терапии дигидрокверцетином на биомаркеры накопления сенесцентных клеток, жесткость сосудов и клиническое состояние пациентов с ХСН.

Материалы и методы. Планируется проведение рандомизированного сравнительного двойного слепого клинического исследования, включающего 60 пациентов, после незапланированного визита по поводу симптомов и/или признаков застойных явлений, вызванных сердечной недостаточностью, и требующих госпитализации и/или усиления диуретической терапии. Пациентам, рандомизированным в две группы в соотношении 2:1 ( n = 40 в 1 группе, n = 20 во второй), в дополнение к стандартной терапии будет назначена жидкая водорастворимая форма дигидрокверцетина в дозе 100 мг в сутки однократно (1-я группа) либо в дозе 30 мг в сутки (2-я группа) однократно («Таксифолин аква», ООО «Продвинутые технологии»). Набор в исследование будет проходить в течение 9 месяцев в одном исследовательском центре. Наблюдение за пациентами будет проводиться в течение 16 недель с момента включения. Контрольные визиты предусмотрены через 8 и 16 недель, на которых будут оцениваться показатели качества жизни, скорость пульсовой волны, функциональный статус, маркеры нагрузки сенесцентными клетками.

Текущий статус исследования: в настоящее время ведется набор пациентов.