Создание и характеристика культур мезенхимных стромальных клеток человека с пролонгированным пролиферативным потенциалом для задач регенеративной медицины

Изучение молекулярных механизмов процессов регенерации требует удобных объектов для in vitro и in vivo исследований. In vitro такую функцию могут выполнять клеточные культуры. Существенным ограничением применения клеточных культур, полученных из тканей пациента, является их быстрое старение и утрата специфичных свойств исходной клеточной культуры. Возможным подходом к пролонгированию пролиферативной активности и сохранению свойств первичной клеточной культуры является повышение экспрессии каталитического компонента теломеразы (TERT). В данном исследовании мы оценили эффективность получения культур мезенхимных стромальных клеток (МСК) жировой ткани человека с пролонгированным пролиферативным потенциалом путем принудительной гиперэкспрессии гена TERT человека и изучили свойства полученных культур. Было установлено, что полученные культуры МСК способны преодолевать до 38–63 удвоений клеточной популяции (УКП), сохраняют чувствительность к норадреналину, серотонину, глутамату, ГАМК, паратиреоидному гормону, ангиотензину II и гистамину по меньшей мере до 26 УКП, сохраняют МСК-специфичный иммунофенотип до 36 УКП, а также способность к дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлении — не менее чем до 39 УКП. Более того, генетическая модификация культур МСК геном TERT человека (hTERT) позволяет стабилизировать качественный и количественный состав секретома МСК при длительном пассировании (по меньшей мере до 30 УКП). Полученные результаты позволяют рассматривать гиперэкспрессию TERT как перспективный подход к получению культур МСК с пролонгированной пролиферативной активностью, а сами культуры тМСК — как стабильный и удобный объект для решения широкого спектра фундаментальных и прикладных задач регенеративной медицины.

1. Varier P, Raju G, Madhusudanan P, Jerard C, Shankarappa SA. A Brief Review of In Vitro Models for Injury and Regeneration in the Peripheral Nervous System. Int J Mol Sci. 2022;23(2):816. DOI: 10.3390/ijms23020816

2. Karagyaur M, Primak A, Efimenko A, Skryabina M, Tkachuk V. The Power of Gene Technologies: 1001 Ways to Create a Cell Model. Cells. 2022;11(20):3235. DOI: 10.3390/cells11203235

3. Voloshin N, Tyurin-Kuzmin P, Karagyaur M, Akopyan Z, Kulebyakin K. Practical Use of Immortalized Cells in Medicine: Current Advances and Future Perspectives. Int J Mol Sci. 2023;24(16):12716. DOI: 10.3390/ijms241612716

4. Lenz LS, Wink MR. The other side of the coin: mesenchymal stromal cell immortalization beyond evasion of senescence. Hum Cell. 2023;36(5):1593–1603. DOI: 10.1007/s13577-023-00925-3

5. Basalova N, Illarionova M, Skryabina M, Vigovskiy M, Tolstoluzhinskaya A, Primak A, et al. Advances and Obstacles in Using CRISPR/Cas9 Technology for Non-Coding RNA Gene Knockout in Human Mesenchymal Stromal Cells. Noncoding RNA. 2023;9(5):49. DOI: 10.3390/ncrna9050049

6. Hahn WC. Immortalization and transformation of human cells. Mol Cells. 2002;13(3):351–361, DOI: 10.1016/S1016-8478(23)15045-X

7. Meltzer PS, Guan XY, Trent JM. Telomere capture stabilizes chromosome breakage. Nat Genet. 1993;4(3):252–255. DOI: 10.1038/ng0793-252

8. Richter M, Piwocka O, Musielak M, Piotrowski I, Suchorska WM, Trzeciak T. From Donor to the Lab: A Fascinating Journey of Primary Cell Lines. Front Cell Dev Biol. 2021;9:711381. DOI: 10.3389/fcell.2021.711381

9. Longo PA, Kavran JM, Kim MS, Leahy DJ. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enzymol. 2013;529:227–240. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5

10. Tyurin-Kuzmin PA, Karagyaur MN, Kulebyakin KY, Dyikanov DT, Chechekhin VI, Ivanova AM, et al. Functional Heterogeneity of Protein Kinase A Activation in Multipotent Stromal Cells. Int J Mol Sci. 2020;21(12):4442. DOI: 10.3390/ijms21124442

11. Böcker W, Yin Z, Drosse I, Haasters F, Rossmann O, Wierer M, et al. Introducing a singlecell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 2008;12(4):1347–1359. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2008.00299.x

12. Jun ES, Lee TH, Cho HH, Suh SY, Jung JS. Expression of telomerase extends longevity and enhances differentiation in human adipose tissue-derived stromal cells. Cell Physiol Biochem. 2004;14(4–6):261–268. DOI: 10.1159/000080335

13. Kulebyakin K, Tyurin-Kuzmin P, Efimenko A, Voloshin N, Kartoshkin A, Karagyaur M, et al. Decreased Insulin Sensitivity in Telomerase-Immortalized Mesenchymal Stem Cells Affects Efficacy and Outcome of Adipogenic Differentiation in vitro. Front Cell Dev Biol. 2021;9:662078. DOI: 10.3389/fcell.2021.662078

14. Ozkinay C, Mitelman F. A simple trypsin-Giemsa technique producing simultaneous Gand C-banding in human chromosomes. Hereditas. 1979;90(1):1–4. DOI: 10.1111/j.1601-5223.1979.tb01287.x

15. An International System for Human Cytogenomic Nomenclature. Eds. McGowan-Jordan J, Hastings RS, Moore S. S.Karger AG, Basel (Switzerland), 2020. DOI: 10.1159/isbn.978-3-318-06867-2

16. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Krause DS, et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 2006;8:315–317. DOI: 10.1080/14653240600855905

17. Bourin P, Bunnell BA, Casteilla L, Dominici M, Katz AJ, March KL, et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissuederived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 2013;15(6):641–648. DOI: 10.1016/j.jcyt.2013.02.006

18. Viswanathan S., Shi Y., Galipeau J., Krampera M., Leblanc K., Martin I. et al. Mesen-chymal Stem versus Stromal Cells: International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT®) Mesenchymal Stromal Cell Committee Position Statement on Nomenclature. Cytother. 2019;21(10):1019–1024. DOI: 10.1016/j.jcyt.2019.08.002

19. Zietzer A, Hosen MR, Goody PR, Werner N, Nickenig G, Jansen F. HnRNPU regulates intra-and intercellular microRNA trafficking in a sequence specific manner, Europ Heart J. 2020;41(Suppl. 2):ehaa946.3611. DOI: 10.1093/ehjci/ehaa946.3611

20. Zietzer A, Hosen MR, Wang H, Goody PR, Sylvester M, Latz E, et al. The RNA-binding protein hnRNPU regulates the sorting of microRNA-30c-5p into large extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2020;9(1):1786967. DOI: 10.1080/20013078.2020.1786967

21. Karagyaur M, Primak A, Efimenko A, Skryabina M, Tkachuk V. The Power of Gene Technologies: 1001 Ways to Create a Cell Model. Cells. 2022;11(20):3235. DOI: 10.3390/cells11203235

22. Chen J. The Cell-Cycle Arrest and Apoptotic Functions of p53 in Tumor Initiation and Progression. Cold Spring Harb Perspect Med. 2016;6(3):a026104. DOI: 10.1101/cshperspect.a026104

23. Engeland K. Cell cycle regulation: p53-p21-RB signaling. Cell Death Differ. 2022;29(5):946–960. DOI: 10.1038/s41418-022-00988-z

24. Simon M, Köster G, Menon AG, Schramm J. Functional evidence for a role of combined CDKN2A (p16-p14(ARF))/CDKN2B (p15) gene inactivation in malignant gliomas. Acta Neuropathol. 1999;98(5):444–452. DOI: 10.1007/s004010051107

25. Toouli CD, Huschtscha LI, Neumann AA, Noble JR, Colgin LM, Hukku B, Reddel RR. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 2002;21(1):128–139. DOI: 10.1038/sj.onc.1205014

26. Jiang XR, Jimenez G, Chang E, Frolkis M, Kusler B, Sage M, et al. Telomerase expression in human somatic cells does not induce changes associated with a transformed phenotype. Nat Genet. 1999;21(1):111–114. DOI: 10.1038/5056

27. Tyurin-Kuzmin PA, Karagyaur MN, Kulebyakin KY, Dyikanov DT, Chechekhin VI, Ivanova AM, et al. Functional Heterogeneity of Protein Kinase A Activation in Multipotent Stromal Cells. Int J Mol Sci. 2020;21(12):4442. DOI: 10.3390/ijms21124442

28. Воронцова МВ, Кулебякин КЮ, Маказан НВ, Созаева ЛС, Тюрин-Кузьмин ПА. Паратиреоидный гормон в регуляции процессов роста и резорбции кости в норме и патологии. Вестник Российской академии медицинских наук. 2021;76(5):506–517.

29. Kulebyakin K, Tyurin-Kuzmin P, Efimenko A, Voloshin N, Kartoshkin A, Karagyaur M, et al. Decreased Insulin Sensitivity in Telomerase-Immortalized Mesenchymal Stem Cells Affects Efficacy and Outcome of Adipogenic Differentiation in vitro. Front Cell Dev Biol. 2021;9:662078. DOI: 10.3389/fcell.2021.662078

30. Tyurin-Kuzmin PA, Chechekhin VI, Ivanova AM, Dyikanov DT, Sysoeva VY, Kalini-na NI, Tkachuk VA. Noradrenaline Sensitivity Is Severely Impaired in Immortalized Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cell Line. Int J Mol Sci. 2018;19(12):3712. DOI: 10.3390/ijms19123712

31. Cai Y, Laustsen A, Zhou Y, Sun C, Anderson MV, Li S, et al. Targeted, homology-driven gene insertion in stem cells by ZFN-loaded ‘all-in-one’ lentiviral vectors. Elife. 2016;5:e12213. DOI: 10.7554/eLife.12213

32. Kane NM, Nowrouzi A, Mukherjee S, Blundell MP, Greig JA, Lee WK, et al. Lentivirus-mediated Reprogramming of Somatic Cells in the Absence of Transgenic Transcription Factors. Mol Ther. 2010;18(12):2139–2145. DOI: 10.1038/mt.2010.231

33. Barsov EV. Telomerase and primary T cells: biology and immortalization for adoptive immunotherapy. Immunotherapy. 2011;3(3):407–421. DOI: 10.2217/imt.10.107

34. Dos Santos A, Lyu N, Balayan A, Knight R, Zhuo KS, Sun Y, et al. Generation of Functional Immortalized Human Corneal Stromal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2022;23(21):13399. DOI: 10.3390/ijms232113399

35. Kalinina N, Kharlampieva D, Loguinova M, Butenko I, Pobeguts O, Efimenko A, et al. Characterization of secretomes provides evidence for adipose-derived mesenchymal stromal cells subtypes. Stem Cell Res Ther. 2015;6:221. DOI: 10.1186/s13287-015-0209-8

36. Carvalho MM, Teixeira FG, Reis RL, Sousa N, Salgado AJ. Mesenchymal stem cells in the umbilical cord: phenotypic characterization, secretome and applications in central nervous system regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 2011;6(3):221–228. DOI: 10.2174/157488811796575332