Формирование тканеинженерной конструкции хряща на основе микрочастиц децеллюляризованного хряща в перфузионном биореакторе

Формирование тканевого эквивалента на основе инъекционной формы микродисперсного скаффолда — микрочастиц децеллюляризованного хряща свиньи (ДецХс) — представляется перспективной технологией для восстановления дефектов хрящевой ткани. Целью данной работы было получение и сравнительное исследование тканеинженерной конструкции (ТИК) на основе микрочастиц ДецХс и мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в статических условиях и в перфузионном биореакторе. Материалы и методы. Процесс децеллюляризации включал циклы замораживания и оттаивания (-196...+37 °C), использование поверхностно-активных веществ (Triton X-100 и додецилсульфат натрия), а также обработку ДНКазой. Морфология поверхности и ближайшего подповерхностного слоя образцов была исследована с помощью сканирующей электронной микроскопии. Каждая ТИК состояла из 5×10⁵ МСК и 5 мг ДецХс. Результаты. Установлено, что по сравнению со статическими условиями культивирование МСК на микрочастицах ДецХс в перфузионном биореакторе в течение 14 суток позволяет увеличить пролиферативную активность клеток с последующей хондрогенной дифференцировкой, о чем говорит способность клеточной компоненты ТИК синтезировать внеклеточный матрикс (ВКМ), гистохимический анализ которого выявил наличие коллагена и гликозаминогликанов (ГАГ). Заключение. Показана возможность формирования ТИК хряща на основе ДецХс и МСК в условиях 3D-культивирования как в статических условиях, так и в перфузионном биореакторе. Культивирование МСК на ДецХс в условиях потока при скорости 1 мм/мин способствовало увеличению пролиферативной активности клеток по сравнению со статическими условиями, а также поддерживало способность клеток синтезировать ВКМ, гистохимический анализ которого выявил наличие общего коллагена и ГАГ, что может являться подтверждением хондрогенной дифференцировки МСК.

1. Alcaide-Ruggiero L, Molina-Hernández V, Granados MM, Domínguez JM. Main and Minor Types of Collagens in the Articular Cartilage: The Role of Collagens in Repair Tissue Evaluation in Chondral Defects. Int J Mol Sci. 2021;22(24):13329. DOI: 10.3390/ijms222413329

2. Almonte-Becerril M, Navarro-Garcia F, Gonzalez-Robles A, Vega-Lopez MA, Lavalle C, Kouri JB. Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of Osteoarthritis within an experimental model. Apoptosis. 2010;15(5):631–638. DOI: 10.1007/s10495-010-0458-z

3. Suh DS, Yoo JC, Woo SH, Kwak AS. Intra-Articular Atelocollagen Injection for the Treatment of Articular Cartilage Defects in Rabbit Model. Tissue Eng Regen Med. 2021;18(4):663–670. DOI: 10.1007/s13770-021-00337-0

4. Lian C, Wang X, Qiu X, Wu Z, Gao B, Liu L, et al. Collagen type II suppresses articular chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis progression by promoting integrin β1-SMAD1 interaction. Bone Res. 2019;7:8. DOI: 10.1038/s41413-019-0046-y

5. Carneiro DC, Araújo LT, Santos GC, Damasceno PKF, Vieira JL, Santos RRD, et al. Clinical Trials with Mesenchymal Stem Cell Therapies for Osteoarthritis: Challenges in the Regeneration of Articular Cartilage. Int J Mol Sci. 2023;24(12):9939. DOI: 10.3390/ijms24129939

6. Song Y, Jorgensen C. Mesenchymal Stromal Cells in Osteoarthritis: Evidence for Structural Benefit and Cartilage Repair. Biomedicines. 2022;10(6):1278. DOI: 10.3390/biomedicines10061278

7. Lam ATL, Reuveny S, Oh SK. Human mesenchymal stem cell therapy for cartilage repair: Review on isolation, expansion, and constructs. Stem Cell Res. 2020;44:101738. DOI: 10.1016/j.scr.2020.101738

8. Nemets EA, Lazhko AE, Basok YB, Kirsanova LA, Kirillova AD, Sevastianov VI. Preparation of Tissue-Specific Matrix from Decellularized Porcine Cartilage. Russian Journal of Physical Chemistry B. 2020;14(8):1245–1251. DOI: 10.1134/S1990793120080059

9. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233–3243. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2011.01.057

10. Reina-Mahecha A, Beers MJ, van der Veen HC, Zuhorn IS, van Kooten TG, Sharma PK. A Review of the Role of Bioreactors for iPSCs-Based Tissue-Engineered Articular Cartilage. Tissue Eng Regen Med. 2023;20(7):1041–1052. DOI: 10.1007/s13770-023-00573-6

11. Ravichandran A, Liu Y, Teoh SH. Review: bioreactor design towards generation of relevant engineered tissues: focus on clinical translation. J Tissue Eng Regen Med. 2018;12(1):e7– e22. DOI: 10.1002/term.2270

12. Aprile P, Kelly DJ. Hydrostatic Pressure Regulates the Volume, Aggregation and Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Derived Stromal Cells. Front Bioeng Biotechnol. 2021;15:8:619914. DOI: 10.3389/fbioe.2020.619914

13. Sevastianov VI, Basok YB, Grigoriev AM, Nemets EA, Kirillova AD, Kirsanova LA, et al. Decellularization of cartilage microparticles: Effects of temperature, supercritical carbon dioxide and ultrasound on biochemical, mechanical, and biological properties. J Biomed Mater Res A. 2023;111(4):543–555. DOI: 10.1002/jbm.a.37474

14. Севастьянов ВИ, Басок ЮБ, Григорьев АМ, Кирсанова ЛА, Василец ВН. Применение технологии тканевой инженерии для формирования хрящевой ткани человека в проточном биореакторе. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2017;19(3):81–92. DOI: 10.15825/1995-1191-2017-3-81-92

15. Theodoridis K, Aggelidou E, Manthou M, Demiri E, Bakopoulou A, Kritis A. Assessment of cartilage regeneration on 3D collagen-polycaprolactone scaffolds: evaluation of growth media in static and in perfusion bioreactor dynamic culture. Colloids Surf B Biointerfaces. 2019;183:110403. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2019.110403

16. Kock LM, Malda J, Dhert WJ, Ito K, Gawlitta D. Flow-perfusion interferes with chondrogenic and hypertrophic matrix production by mesenchymal stem cells. J Biomech. 2014;47(9):2122–2129. DOI: 10.1016/j.jbiomech.2013.11.006

17. Schulz RM, Wüstneck N, van Donkelaar CC, Shelton JC, Bader A. Development and validation of a novel bioreactor system for load- and perfusion-controlled tissue engineering of chondrocyte-constructs. Biotechnol Bioeng. 2008;101(4):714–728. DOI: 10.1002/bit.21955

18. Tiğli RS, Cannizaro C, Gümüşderelioğlu M, Kaplan DL. Chondrogenesis in perfusion bioreactors using porous silk scaffolds and hESC-derived MSCs. J Biomed Mater Res A. 2011;96(1):21–28. DOI: 10.1002/jbm.a.32949

19. Nazempour A, Quisenberry CR, Abu-Lail NI, Van Wie BJ. Combined effects of oscillating hydrostatic pressure, perfusion and encapsulation in a novel bioreactor for enhancing extracellular matrix synthesis by bovine chondrocytes. Cell Tissue Res. 2017;370(1):179–193. DOI: 10.1007/s00441-017-2651-7

20. Silva JC, Moura CS, Borrecho G, et al. Extruded Bioreactor Perfusion Culture Supports the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem/Stromal Cells in 3D Porous Poly(ɛ-Caprolactone) Scaffolds. Biotechnol J. 2020;15(2):e1900078. DOI: 10.1002/biot.201900078