Протеомный анализ интерактома белка активации фибробластов альфа (FAPα) в активированных фибробластах человека: идентификация потенциальных партнеров, субстратов и кооперация с интегриновым сигналингом

Введение. Белок активации фибробластов альфа (FAPα) представляет собой трансмембранную сериновую протеазу, экспрессия которой резко возрастает в стромальных клетках при фиброзе и развитии опухолей. Известно, что FAPα участвует в ремоделировании внеклеточного матрикса, однако полный спектр его потенциальных белковых партнеров и ферментативных субстратов в активированных фибробластах остается недостаточно охарактеризованным. Целью настоящей работы явилась идентификация белков, образующих комплексы с FAPα в активированных фибробластах человека, оценка их субстратного статуса и верификация кооперации с интегриновым сигналингом.
Материалы и методы. Первичные дермальные фибробласты человека активировали путем обработки TGF-β1 (10 нг/мл, 24 ч). Иммунопреципитацию FAPα проводили с использованием двух независимых антител (Cell Signaling и R&D Systems), специфичность подтверждали вестерн-блоттингом. Белки, элюированные из иммунопреципитатов, осаждали трихлоруксусной кислотой, подвергали трипсинолизу и анализировали методом масс-спектрометрии (Q Exactive Plus). Данные обрабатывали с использованием программных пакетов MaxQuant и Perseus. Функциональную аннотацию идентифицированных белков выполняли с использованием GO Enrichment Analysis. Наличие предполагаемых сайтов расщепления FAPα оценивали биоинформатически. Взаимодействие с интегринами β1, αV и TGFβRII верифицировали методом вестерн-блоттинга.
Результаты. Специфичность иммунопреципитации была подтверждена для обоих типов антител. В двух независимых повторностях идентифицировано 47 белков, из которых 16 специфически копреципитировались с FAPα. Функциональная аннотация выявила среди этих белков значимое обогащение пептидазами (химаза, карбоксипептидаза D), ингибиторами протеаз (аннексин А2) и молекулами клеточной адгезии (тенасцин). Анализ сайтов расщепления показал, что только белок ZC3H4 содержит одновременно мотивы GP, PPGP и GPA, тогда как карбоксипептидаза D содержит мотив GPA. Вестерн-блоттинг подтвердил образование комплексов FAPα с интегринами β1 и αV, а также снижение копреципитации TGFβRII после активации клеток.
Выводы. В ходе работы идентифицировано 16 потенциальных белков-партнеров FAPα в активированных фибробластах; среди них ZC3H4 является наиболее вероятным прямым субстратом. Экспериментально подтверждена кооперация FAPα с интегринами β1 и αV. Полученные данные расширяют представления о функциональной роли FAPα и создают основу для дальнейшего изучения ее роли в патогенезе фиброза и опухолевой прогрессии.

1. Zhang XL, Xiao W, Qian JP, Yang WJ, Xu H, Xu X da, et al. The Role and Application of Fibroblast Activating Protein. Curr Mol Med. 2024;24(9):1097–1110. DOI: 10.2174/1566524023666230530095305. PubMed PMID: 37259211.

2. Butuzova DA, Kulebyakina MA, Basalova NA, Efimenko AYu. Fibroblast Activation Protein Alpha (FAPα) as a Promising Target in the Diagnostics and Treatment of Cancer and Fibrotic Diseases: Recent Approaches to Imaging and Assessment of Functional Activity. Biochemistry Moscow. 2025 Feb;90(S1):S135–145. DOI: 10.1134/S000629792460279X

3. Kelly T, Huang Y, Simms AE, Mazur A. Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;297:83–116. DOI: 10.1016/B978-0-12-394308-8.00003-0. PubMed PMID: 22608558.

4. Basalova N, Alexandrushkina N, Grigorieva O, Kulebyakina M, Efimenko A. Fibroblast Activation Protein Alpha (FAPα) in Fibrosis: Beyond a Perspective Marker for Activated Stromal Cells? Biomolecules. 2023 Nov 29;13(12):1718. DOI: 10.3390/biom13121718

5. Ghersi G, Zhao Q, Salamone M, Yeh Y, Zucker S, Chen WT. The Protease Complex Consisting of Dipeptidyl Peptidase IV and Seprase Plays a Role in the Migration and Invasion of Human Endothelial Cells in Collagenous Matrices. Cancer Research. 2006 May 1;66(9):4652–4661. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-05-1245

6. Basalova NA, Vigovskiy MA, Popov VS, Lagereva EA, Grigorieva OA, Efimenko AY. The Role of Activated Stromal Cells in Fibrotic Foci Formation and Reversion. Cells. 2024 Dec 13;13(24):2064. DOI: 10.3390/cells13242064

7. Edosada CY, Quan C, Wiesmann C, Tran T, Sutherlin D, Reynolds M, et al. Selective Inhibition of Fibroblast Activation Protein Protease Based on Dipeptide Substrate Specificity. Journal of Biological Chemistry. 2006 Mar 17;281(11):7437–7444. DOI: 10.1074/jbc.M511112200

8. Aggarwal S, Brennen WN, Kole TP, Schneider E, Topaloglu O, Yates M, et al. Fibroblast activation protein peptide substrates identified from human collagen I derived gelatin cleavage sites. Biochemistry. 2008 Jan 22;47(3):1076–1086. DOI: 10.1021/bi701921b. PubMed PMID: 18095711. PubMed Central PMCID: PMC4696028.

9. Mori N, Jin J, Krishnamachary B, Mironchik Y, Wildes F, Vesuna F, et al. Functional roles of FAP-α in metabolism, migration and invasion of human cancer cells. Front Oncol. 2023;13:1068405. DOI: 10.3389/fonc.2023.1068405. PubMed PMID: 36937451. PubMed Central PMCID: PMC10015381.

10. Xin L, Gao J, Zheng Z, Chen Y, Lv S, Zhao Z, et al. Fibroblast Activation Protein-α as a Target in the Bench-to-Bedside Diagnosis and Treatment of Tumors: A Narrative Review. Front Oncol. 2021 Aug 19;11:648187. DOI: 10.3389/fonc.2021.648187

11. Guan C, Cheng N, Tong Y, Li Y, Liu J, Luo H, et al. Targeting the FAPα/Integrin αvβ1 complex attenuates hepatic stellate cell activation and liver fibrosis. Biochem Pharmacol. 2026 May;247:117801. DOI: 10.1016/j.bcp.2026.117801. PubMed PMID: 41687828.

12. Tolstoluzhinskaya AE, Basalova NA, Karagyaur MN, Efimenko AY. Tissue-specific expression and alternative splicing of fibroblast activation protein alpha (FAPα) gene in human stromal cells. Genes & Cells. 2025 Apr 7;20(1):54–67. DOI: 10.17816/gc636876

13. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680–685. DOI: 10.1038/227680a0. PubMed PMID: 5432063.

14. Nowacki FC, Swain MT, Klychnikov OI, Niazi U, Ivens A, Quintana JF, et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 2015;4:28665. DOI: 10.3402/jev.v4.28665. PubMed PMID: 26443722. PubMed Central PMCID: PMC4595467.

15. Cox J, Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 2008 Dec;26(12):1367–1372. DOI: 10.1038/nbt.1511. PubMed PMID: 19029910.

16. Tyanova S, Temu T, Sinitcyn P, Carlson A, Hein MY, Geiger T, et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 2016 Sep;13(9):731–740. DOI: 10.1038/nmeth.3901. PubMed PMID: 27348712.

17. ю Schaab C, Geiger T, Stoehr G, Cox J, Mann M. Analysis of high accuracy, quantitative proteomics data in the MaxQB database. Mol Cell Proteomics. 2012 Mar;11(3):M111.014068. DOI: 10.1074/mcp.M111.014068. PubMed PMID: 22301388. PubMed Central PMCID: PMC3316731.

18. Thomas PD, Ebert D, Muruganujan A, Mushayahama T, Albou L, Mi H. PANTHER : Making genome-scale phylogenetics accessible to all. Protein Science. 2022 Jan;31(1):8–22. DOI: 10.1002/pro.4218

19. Juillerat-Jeanneret L, Tafelmeyer P, Golshayan D. Fibroblast activation protein-α in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase? Expert Opinion on Therapeutic Targets. 2017 Oct 3;21(10):977–991. DOI: 10.1080/14728222.2017.1370455. PubMed PMID: 28829211.

20. Fitzgerald AA, Weiner LM. The role of fibroblast activation protein in health and malignancy. Cancer Metastasis Rev. 2020 Sep 1;39(3):783–803. DOI: 10.1007/s10555-020-09909-3

21. Imanaka-Yoshida K, Hiroe M, Yoshida T. Interaction between cell and extracellular matrix in heart disease: multiple roles of tenascin-C in tissue remodeling. Histol Histopathol. 2004 Apr;19(2):517–525. DOI: 10.14670/HH-19.517. PubMed PMID: 15024713.

22. Li X, Ye Y, Peng K, Zeng Z, Chen L, Zeng Y. Histones: The critical players in innate immunity. Front Immunol. 2022 Nov 21;13:1030610. DOI: 10.3389/fimmu.2022.1030610. PubMed PMID: 36479112. PubMed Central PMCID: PMC9720293.

23. Roos J, Zinngrebe J, Huber-Lang M, Lupu L, Schmidt MA, Strobel H, et al. Trauma-associated extracellular histones mediate inflammation via a MYD88-IRAK1-ERK signaling axis and induce lytic cell death in human adipocytes. Cell Death Dis. 2024 Apr 23;15(4):285. DOI: 10.1038/s41419-024-06676-9

24. Dai MS, Zeng SX, Jin Y, Sun XX, David L, Lu H. Ribosomal Protein L23 Activates p53 by Inhibiting MDM2 Function in Response to Ribosomal Perturbation but Not to Translation Inhibition. Mol Cell Biol. 2004 Sep;24(17):7654–7668. DOI: 10.1128/MCB.24.17.7654-7668.2004. PubMed PMID: 15314173. PubMed Central PMCID: PMC506971.

25. Zhang HE, Hamson EJ, Koczorowska MM, Tholen S, Chowdhury S, Bailey CG, et al. Identification of Novel Natural Substrates of Fibroblast Activation Protein-alpha by Differential Degradomics and Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 2019 Jan;18(1):65–85. DOI: 10.1074/mcp.RA118.001046

26. Heldin CH, Moustakas A. Signaling Receptors for TGF-β Family Members. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2016 Aug 1;8(8):a022053. DOI: 10.1101/cshperspect.a022053. PubMed PMID: 27481709. PubMed Central PMCID: PMC4968163.

27. Han Z, Ma Y, Cao G, Ma Z, Chen R, Cvijic ME, et al. Integrin αVβ1 regulates procollagen I production through a non-canonical transforming growth factor β signaling pathway in human hepatic stellate cells. Biochem J. 2021 May 14;478(9):1689–1703. DOI: 10.1042/BCJ20200749. PubMed PMID: 33876829.