Выделение и культивирование клеток эпителия эндометрия человека

Целью данной работы была разработка и оптимизация методов получения и культивирования клеток эпителия эндометрия человека из неинвазивного источника — менструальной крови. Исследование направлено на создание персонализированных моделей эндометрия in vitro для изучения механизмов имплантации эмбриона, поиска маркеров рецептивности эндометрия и разработки новых подходов к лечению гинекологических заболеваний, включая бесплодие.
Методы. Для получения клеток эндометрия использовалась менструальная кровь, собранная от здоровых доноров. Фрагменты эндометрия выделялись с помощью фильтрации и ферментативной обработки. Культивирование клеток проводилось в различных условиях: в виде монослоя (2D), тканевой культуры и органоидов (3D). Для подтверждения эпителиального фенотипа использовалось иммуноцитохимическое окрашивание на маркеры цитокератин и Е-кадгерин. Для исследования эндоцитоза рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) в тканевой культуре использовался флюоресцентно-меченный эпидермальный фактора роста (EGF).
Результаты. Было показано, что менструальная кровь является доступным источником для получения жизнеспособных клеток эндометрия. Полученная тканевая культура эндометрия сохраняет архитектуру ткани и может служить моделью для исследования эндоцитоза рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Культивирование клеток эпителия эндометрия в виде органоидов позволило сохранить эпителиальный фенотип и пролиферативную активность клеток в течение длительного времени. Органоиды демонстрировали способность к самоорганизации и формированию однослойных клеточных структур, что подтверждает их пригодность для моделирования процессов, происходящих в эндометрии in vivo. В то же время культивирование в 2D-условиях приводило к быстрому старению клеток и потере их функциональных свойств.
Заключение. Разработанные методы культивирования клеток эпителия эндометрия в виде тканевой культуры и органоидов открывают новые возможности для изучения механизмов имплантации эмбриона и поиска маркеров рецептивности эндометрия. Полученные результаты имеют большое значение для развития персонализированной медицины, в частности для повышения эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и разработки новых терапевтических подходов к лечению гинекологических заболеваний.

1. Goetz LH, Schork NJ. Personalized medicine: motivation, challenges, and progress. Fertil Steril. 2018 Jun;109(6):952–963. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2018.05.006

2. Villalón-García I, Álvarez-Córdoba M, Suárez-Rivero JM, Povea-Cabello S, Talaverón-Rey M, Suárez-Carrillo A, et al. Precision Medicine in Rare Diseases. Diseases. 2020;8(4):42. DOI: 10.3390/diseases8040042

3. Wang H, Bocca S, Anderson S, Yu L, Rhavi BS, Horcajadas J, Oehninger S. Sex steroids regulate epithelial-stromal cell cross talk and trophoblast attachment invasion in a three-dimensional human endometrial culture system. Tissue Eng Part C Methods. 2013;19(9):676. DOI: 10.1089/ten.TEC.2012.0616

4. Montin D, Santilli V, Beni A, Costagliola G, Martire B, Mastrototaro MF, et al. Towards personalized vaccines. Front Immunol. 2024;3:1436108. DOI: 10.3389/fimmu.2024.1436108

5. Owen MC, Kopecky BJ. Targeting macrophages in organ transplantation: a step toward personalized medicine. Transplantation. 2024;108(12):2045. DOI: 10.1097/TP.0000000000004978

6. Zhang PY, Yu Y. Precise personalized medicine in gynecology cancer and infertility. Front Cell Dev Biol. 2020;7:382. DOI: 10.3389/fcell.2019.00382

7. Beim PY, Elashoff M, Hu-Seliger TT. Personalized reproductive medicine on the brink: progress, opportunities and challenges ahead. Reprod Biomed Online. 2013;27(6):611–623. DOI: 10.1016/j.rbmo.2013.09.010

8. Collins SC. Precision reproductive medicine: multigene panel testing for infertility risk assessment. J Assist Reprod Genet. 2017;34(8):967–973. DOI: 10.1007/s10815-017-0938-y

9. Krawetz SA. Personalized precision reproductive medicine and diagnostics. Syst Biol Reprod Med. 2017;63(1):1. DOI: 10.1080/19396368.2017.1278984

10. Francés-Herrero E, Lopez R, Hellström M, de Miguel-Gómez L, Herraiz S, Brännström M, et al. Bioengineering trends in female reproduction: a systematic review. Hum Reprod Update. 2022;28(6):798–837. DOI: 10.1093/humupd/dmac025

11. Rodríguez-Eguren A, Bueno-Fernandez C, Gómez-Álvarez M, Francés-Herrero E, Pellicer A, Bellver J, et al. Evolution of biotechnological advances and regenerative therapies for endometrial disorders: a systematic review. Hum Reprod Update. 2024;30(5):584–613. DOI: 10.1093/humupd/dmae013

12. Zubizarreta ME, Xiao S. Bioengineering models of female reproduction. Biodes Manuf. 2020;3(3):237–251. DOI: 10.1007/s42242-020-00082-8

13. Sittadjody S, Criswell T, Jackson JD, Atala A, Yoo JJ. Regenerative medicine approaches in bioengineering female reproductive tissues. Reprod Sci. 2021;28(6):1573–1595. DOI: 10.1007/s43032-021-00548-9

14. Christian M, Mak I, White JO, Brosens JJ. Mechanisms of decidualization. Reprod Biomed Online. 2002;4(suppl 3):24–30. DOI: 10.1016/s1472-6483(12)60112-6

15. Gellersen B, Brosens IA, Brosens JJ. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Semin Reprod Med. 2007;25(6):445–453. DOI: 10.1055/s-2007-991042

16. Muter J, Lynch VJ, McCoy RC, Brosens JJ. Human embryo implantation. Development. 2023;150(10):dev201507. DOI: 10.1242/dev.201507

17. Gellersen B, Brosens JJ. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocr Rev. 2014;35(6):851–905. DOI: 10.1210/er.2014-1045

18. Lessey BA, Young SL. What exactly is endometrial receptivity? Fertil Steril. 2019;111(4):611–617. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2019.02.009

19. Aganezova NV, Aganezov SS, Gogichashvili KE. Characteristics of endometrial receptivity in women with different endometrial thickness. Obstet Gynecol Reprod. 2022;16(2):108–121. DOI: 10.17749/2313-7347/ob.gyn.rep.2022.303

20. Nikas G. Pinopodes as markers of endometrial receptivity in clinical practice. Hum Reprod. 1999;14(suppl 2):99–106. DOI: 10.1093/humrep/14.suppl_2.99

21. Nikas G, Makrigiannakis A. Endometrial pinopodes and uterine receptivity. Ann N Y Acad Sci. 2003;997:120–123. DOI: 10.1196/annals.1290.042

22. Aunapuu M, Kibur P, Järveots T, Arend A. Changes in morphology and presence of pinopodes in endometrial cells during the luteal phase in women with infertility problems: a pilot study. Medicina (Kaunas). 2018;54(5):69. DOI: 10.3390/medicina54050069

23. Salleh N, Giribabu N. Leukemia inhibitory factor: roles in embryo implantation and in nonhormonal contraception. ScientificWorldJournal. 2014;2014:201514. DOI: 10.1155/2014/201514

24. Aikawa S, Hiraoka T, Matsuo M, Fukui Y, Fujita H, Saito-Fujita T, et al. Spatiotemporal functions of leukemia inhibitory factor in embryo attachment and implantation chamber formation. Cell Death Discov. 2024;10:481. DOI: 10.1038/s41420-024-02228-4

25. Staun-Ram E, Shalev E. Human trophoblast function during the implantation process. Reprod Biol Endocrinol. 2005;3:56. DOI: 10.1186/1477-7827-3-56

26. Gauster M, Moser G, Wernitznig S, Kupper N, Huppertz B. Early human trophoblast development: from morphology to function. Cell Mol Life Sci. 2022;79(6):345. DOI: 10.1007/s00018-022-04377-0

27. Le Saint C, Crespo K, Bourdiec A, Bissonnette F, Buzaglo K, Couturier B, et al. Autologous endometrial cell co-culture improves human embryo development to high-quality blastocysts: a randomized controlled trial. Reprod Biomed Online. 2019;38(3):321–329. DOI: 10.1016/j.rbmo.2018.12.039

28. Айламазян ЭК, Дурнова АО, Полякова ВО, Судалина МН, Кветной ИМ. Ко-культивирование эмбриона человека с эндометрием: оптимизация экстракорпорального оплодотворения. Журнал акушерства и женских болезней. 2012;61(4):16–22.

29. Koot YE, Teklenburg G, Salker MS, Brosens JJ, Macklon NS. Molecular aspects of implantation failure. Biochim Biophys Acta. 2012;1822(12):1943–1950. DOI: 10.1016/j.bbadis.2012.05.017

30. Кибанов МВ, Махмудова ГМ, Гохберг ЯА. Поиск идеального маркера для оценки рецептивности эндометрия: от гистологии до современных молекулярно-генетических подходов. Альманах клинической медицины. 2019;47(1):12–25. DOI: 10.18786/2072-0505-2019-47-005

31. Гохберг ЯА, Макарова НП, Бабаян АА, Калинина ЕА. Роль различных факторов воздействия на эндометрий в повышении эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2021;1:28–34. DOI: 10.18565/aig.2021.1.28-34

32. Гохберг ЯА, Тимофеева АВ, Калинина ЕА. Молекулярные маркеры рецептивности эндометрия в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2021;11:56–62. DOI: 10.18565/aig.2021.11.56-62

33. Корсак ВС, Смирнова АА, Шурыгина ОВ. Регистр ВРТ Российской ассоциации репродукции человека. Отчет за 2017 год. Проблемы репродукции. 2019;25(6):9–21. DOI: 10.17116/repro2019250619

34. Боярский К.Ю., Гайдуков С.Н., Пальченко Н.А. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ. Проблемы репродукции. 2013;4:51–60.

35. Critchley HOD, Babayev E, Bulun SE, Clark S, Garcia-Grau I, Gregersen PK, et al. Menstruation: science and society. Am J Obstet Gynecol. 2020;223(6):624–664. DOI: 10.1016/j.ajog.2020.06.004

36. Critchley HOD, Maybin JA, Armstrong GM, Williams ARW. Physiology of the endometrium and regulation of menstruation. Physiol Rev. 2020;100(3):1149–1179. DOI: 10.1152/physrev.00031.2019

37. Muter J, Kong CS, Brosens JJ. The role of decidual subpopulations in implantation, menstruation and miscarriage. Front Reprod Health. 2021;3:804921. DOI: 10.3389/frph.2021.804921

38. Земелько ВИ, Гринчук ТМ, Домнина АП, Арцыбашева ИВ, Зенин ВВ, Кирсанов АА и др. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки десквамированного эндометрия. Выделение, характеристика и использование в качестве фидерного слоя для культивирования эмбриональных стволовых линий человека. Цитология. 2011;53:919. DOI: 10.1134/S1990519X12010129

39. Kamentseva RS, Kharchenko MV, Gabdrahmanova GV, Kotov MA, Kosheverova VV, Kornilova ES. EGF, TGF-α and amphiregulin differently regulate endometrium-derived mesenchymal stromal/stem cells. Int J Mol Sci. 2023;24(17):13408. DOI: 10.3390/ijms241713408

40. Tindala K, Filby CE, Cousins FL, Ellery SJ, Vollenhoven B, Palmer K, et al. The composition of menstrual fluid, its applications, and recent advances to understand the endometrial environment: a narrative review. F&S Reviews, 2024;5(3):100075. DOI: 10.1016/j.xfnr.2024.100075

41. Gargett CE, Schwab KE, Deane JA. Endometrial stem/progenitor cells: the first 10 years. Hum Reprod Update. 2016;22(2):137–163. DOI: 10.1093/humupd/dmv051

42. Ilavarasi CR, Jyothi GS, Alva NK. Study of the efficacy of Pipelle biopsy technique to diagnose endometrial diseases in abnormal uterine bleeding. J Midlife Health. 2019;10(2):75–80. DOI: 10.4103/jmh.JMH_109_18

43. Cindrova-Davies T, Zhao X, Elder K, Jones CJP, Moffett A, Burton GJ, Turco MY. Menstrual flow as a non-invasive source of endometrial organoids. Commun Biol. 2021;4:1. DOI: 10.1038/s42003-021-02194-y

44. Bozorgmehr M, Gurung S, Darzi S, Nikoo S, Kazemnejad S, Zarnani AH, Gargett CE. Endometrial and menstrual blood mesenchymal stem/stromal cells: biological properties and clinical application. Front Cell Dev Biol. 2020;8:497. DOI: 10.3389/fcell.2020.00497

45. Sanchez-Mata A, Gonzalez-Muñoz E. Understanding menstrual blood-derived stromal/stem cells: definition and properties. Are we rushing into their therapeutic applications? iScience. 2021;24(12):103501. DOI: 10.1016/j.isci.2021.103501

46. Quenby S, Brosens JJ. Human implantation: a tale of mutual maternal and fetal attraction. Biol Reprod. 2013;88(3):81. DOI: 10.1095/biolreprod.113.108886

47. Brosens JJ, Parker MG, McIndoe A, Pijnenborg R, Brosens IA. A role for menstruation in preconditioning the uterus for successful pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 2009;200(6):615. e1–6. DOI: 10.1016/j.ajog.2008.11.037

48. Macklon NS, Brosens JJ. The human endometrium as a sensor of embryo quality. Biol Reprod. 2014;91(4):98. DOI: 10.1095/biolreprod.114.122846

49. Brosens JJ, Salker MS, Teklenburg G, Nautiyal J, Salter S, Lucas ES, et al. Uterine selection of human embryos at implantation. Sci Rep. 2014;4:3894. DOI: 10.1038/srep03894

50. Иванова НА, Гуменюк ЕГ. Брюшная беременность: что нового? Обзор литературы за 10 лет (2009–2019 гг.). Проблемы репродукции. 2021;27(4):142–149. DOI: 10.17116/repro202127041142

51. Буянова СН, Щукина НА, Чечнева МА. Брюшная беременность. Российский вестник акушера-гинеколога. 2014;14(5):71–74.

52. Корсак ВС. К вопросу о роли эндометрия в имплантации эмбрионов. Проблемы репродукции. 2016;22(2):33–36. DOI: 10.17116/repro201622233-36

53. Никитин АИ. Комментарий к статье В.С. Корсака «К вопросу о роли эндометрия в имплантации эмбрионов». Проблемы репродукции. 2016;22(3):127–128. DOI: 10.17116/repro2016223127-128

54. Домнина АП, Новикова ПВ, Фридлянская ИИ, Шилина МА, Зенин ВВ, Никольский НН. Индукция децидуальной дифференцировки в эндометриальных мезенхимных стволовых клетках. Цитология. 2014;57(12):880–884.

55. Chen JC, Roan NR. Isolation and culture of human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts. Bio Protoc. 2015;5:e1623. DOI: 10.21769/bioprotoc.1623

56. Gargett CE, Schwab KE, Zillwood RM, Nguyen HP, Wu D. Isolation and culture of epithelial progenitors and mesenchymal stem cells from human endometrium. Biol Reprod. 2009;80(6):1136–1145. DOI: 10.1095/biolreprod.108.075226

57. Hewitt SC, Dickson MJ, Edwards N, Hampton K, Garantziotis S, DeMayo FJ. From cup to dish: how to make and use endometrial organoid and stromal cultures derived from menstrual fluid. Frontiers in Endocrinology. 2023;14(14):1220622. DOI: 10.3389/fendo.2023.1220622

58. Boretto M, Cox B, Noben M, Hendriks N, Fassbender A, Roose H, et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 2017;144(10):1775–1786. DOI: 10.1242/dev.148478

59. Murphy AR, Wiwatpanit T, Lu Z, Davaadelger B, Kim JJ. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. J Vis Exp. 2019;(152):e60384. DOI: 10.3791/60384

60. Turco MY, Gardner L, Hughes J, Cindrova-Davies T, Gomez MJ, Farrell L, et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 2017;19(5):568–577. DOI: 10.1038/ncb3516

61. Fitzgerald HC, Dhakal P, Behura SK, Schust DJ, Spencer TE. Self-renewing endometrial epithelial organoids of the human uterus. Proc Natl Acad Sci USA. 2019;116(46):23132–23142. DOI: 10.1073/pnas.1915389116

62. Kibbey MC. Maintenance of the EHS sarcoma and Matrigel preparation. J Tissue Cult Methods. 1994;16(3–4):227–230. DOI: 10.1007/BF01540656

63. Gjorevski N, Sachs N, Manfrin A, Giger S, Bragina ME, Ordóñez-Morán P, et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 2016;539(7630):560–564. DOI: 10.1038/nature20168

64. Hernandez-Gordillo V, Robinton D, Griffith LG. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 2020;254:120125. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2020.120125

65. Sugimoto S, Sato T. Establishment of 3D intestinal organoid cultures from intestinal stem cells. Methods Mol Biol. 2017;1612:97–105. DOI: 10.1007/978-1-4939-7021-6_7

66. Hibaoui Y, Feki A. Organoid models of human endometrial development and disease. Front Cell Dev Biol. 2020;8:84. DOI: 10.3389/fcell.2020.00084